Дифференциальная диагностика аллергического и инфекционного ринитов: уровень внеклеточных пероксидаз в назальном секрете.
ГУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, г. Москва (Директор - акад. РАМН Б.Ф. Семёнов) ГУ Научно-клинический центр оториноларингологии МЗ РФ, г. Москва (Директор - проф. Н.А. Дайхес)
В последнее время в литературе широко дискутируется вопрос о влиянии инфекции на течение персистирующего аллергического ринита.
В проведённом ранее обследовании больных аллергическим ринитом было выявлено, что постоянным представителем микрофлоры в полости носа являются S. aureus и добавочным S. Epidermidis и Corynobacterium spp. [3].
Особое внимание уделяют инфекции, обусловленной S. aureus, что связано со способностью этих микроорганизмов продуцировать суперантигены. Объективно оценить, является ли присутствие S. aureus в назальной полости носительством или фактором персистирующей инфекции, необходимо для назначения адекватной терапии [7].
Хорошо изучена роль нейтрофилов в противоинфекционном иммунном ответе. Важная форма реактивности нейтрофилов – активация кислорода с превращением его в мощный инструмент биоагрессивности. Активация молекулярного кислорода сводится к его частичному восстановлению с образованием частичных радикалов (супераксидный анион, синглетный кислород, гидроксильный радикал) и перекиси водорода. Вместе с миелопероксидазой (МПО) и галогенами они формируют аппарат кислородзависимой биоцидности — важнейшее эффекторное звено фагоцитарных реакций и один из чувствительных индикаторов возбуждения клеток. Интенсивность окислительных процессов имеет прямое отношение к степени цитотоксического эффекта [9].
Таким образом, роль нейтрофилов и продуктов их активации, таких как, например, МПО, до сих пор не изучена. МПО — протеин, высвобождающийся из основных гранул нейтрофилов в процессе их активации. Выявлено достоверное увеличение уровня МПО в сыворотке крови детей с бронхиальной астмой легкой степени, не получавших противовоспалительную терапию, по сравнению с неатопическими пациентами. Предполагается, что нейтрофилы у пациентов с бронхиальной астмой обладают повышенной способностью к активации и высвобождению активных веществ из гранул. И уровень сывороточного МПО резко возрастает при астматическом приступе, вместе с увеличением уровня эозинофильного катионного протеина, что свидетельствует о хроническом воспалении [6].
Очевидно, МПО составляет основной компонент внеклеточных пероксидаз (ПО), обнаруженных в биологических секретах [1]. Кроме МПО в назальном секрете присутствуют эозинофильная пероксидаза и продукты перекисного окисления бактериальных клеток.
Учитывая вышеизложенное, целью исследования явилось определение ПО в назальном секрете больных персистирующим аллергическим ринитом (ПАР), интермиттирующим аллергическим ринитом (ИАР) и инфекционным ринитом (ИР).
Материалы и методы
Пациенты. Были обследованы 163 пациента в возрасте от 1 до 60 лет (средний возраст — 21,9±1,5 года). Все пациенты были разделены на 4 группы. Нозологическая форма была представлена: ПАР, ИАР, ИР и контрольная группа практически здоровых.
- данных анамнеза,
- анкетирования [5],
- скарификационных кожных проб,
- риноцитограммы,
- микробиологического анализа назального секрета,
- рентгенографии околоносовых пазух носа,
- риноскопии, учитывая общепринятые стандарты диагностики [2].
Забор назального секрета проводили абсорбционным методом [7]. Пинцетом в средний носовой ход каждой половины полости носа помещали по ватному шарику на 15 мин. Пинцетом выжимали волокно в 2,7% растворе динатриевой соли этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА), (pH=7,4), извлекали и прикрепляли к верхней части внутри пробирки. Пробирки центрифугировали при 1000 g в течение 20 мин для осаждения целых эритроцитов, лейкоцитов, слизи и корок. Раствор назального секрета измеряли относительно прибавки к раствору ЭДТА.
Определение внеклеточных пероксидаз в назальном секрете. Концентрацию ПО определяли в разведениях надосадочной жидкости 1:1, 1:10, 1:20. Реакцию ПО в исследуемых образцах проводили при добавлении хромогена тетраметилбензидина (ТМБ) [4]. Инкубацию исследуемых образцов с ТМБ проводили в течение 10 минут при температуре 18-25°С. При появлении в лунках синего цвета оценивали результат цветной реакции на спектрофотометре Stap Fax 2200. Реакцию останавливали добавлением серной кислоты, оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 492 нм. В качестве отрицательного контроля использовали 2,7% раствор динатриевой соли ЭДТА. Для построения калибровочной кривой использовали разведения пероксидазы хрена, отработанные опытным путем. Количество ПО определяли с помощью линейного калибровочного графика с учетом объема абсорбированного назального секрета и разведений надосадочной жидкости.
Кожные пробы. Для выявления сенсибилизации к причинным аллергенам было использовано тестирование методом прик-теста с растворами коммерческих аллергенов, содержащие 10 тыс. единиц белкового азота (PNU) в 1 мл. Постановку тестов проводили на сгибательной поверхности предплечья. Учитывали размер волдыря не менее 5 мм спустя 20 минут. В качестве положительного контроля использовали раствор гистамина, в качестве отрицательного — разводящую жидкость.
Риноцитограмма. Назальный секрет собирали из обеих половин носа на предметное стекло. Препарат окрашивали раздельным методом красителями эозином и азуром. Подсчитывали не менее 200 клеточных элементов и определяли процентное содержание нейтрофильных и эозинофильных лейкоцитов, эпителиальных клеток, наличие гранул.
Микробиологическое исследование. Для оценки микрофлоры верхних дыхательных путей проводили бактериологическое исследование мазков со слизистой оболочки полости носа и зева с посевом материала на кровяной, шоколадный агар, среду Сабуро. Засеянные чашки с кровяным и шоколадным агаром инкубировали при температуре 37°С в течение 24 часов в атмосфере с повышенным содержанием CO2 и в анаэробных условиях. Посевы на чашках с плотной средой Сабуро выдерживали при температуре 25°С до 5 суток. После просмотра чашек выделяли чистую культуру микроорганизмов и проводили идентификацию отобранных колоний по общепринятой методике.
Статистическую обработку количественных данных проводили с помощью статистических формул программы Microsoft® Excel 2002 (10.2705.2635) с использованием параметрических и непараметрических статистических величин.
Результаты
Определение ПО в назальном секрете было проведено 163 пациентам с хроническими ринитами. Распределение пациентов по нозологической форме представлено в таблице 1.
Как видно, среди обследованных пациентов преобладали больные с аллергическим ринитом (84/51,5%). Разделение пациентов на группы с ПАР и ИАР использовали для учета острого и хронического аллергического воспаления. То есть, забор назального секрета у больных поллинозом проводили в период весеннего или летнего обострения. У больных ПАР обследование проходило на фоне обычного хронического течения заболевания. Однородность пациентов, распределенных по нозологической форме, равномерное распределение пациентов по полу и возрасту соответствует понятию репрезентативности, что в последующем позволило сравнивать эти группы.
Аллергический ринит (и персистирующий, интермиттирующий) оценивали по степени тяжести в баллах. (Табл. 2).
Очевидно, что у пациентов ИАР заболевание протекало значительно легче, и в 61,4% случаев зафиксировано как легкое, против 17,5% - у пациентов с ПАР. В связи с этим, последующее исследование уровня ПО в назальном секрете проводили в зависимости от степени тяжести течения общего числа больных, страдающих ПАР и ИАР.
При кожном тестировании было показано, что пациенты с ПАР в 77,5% случаев были сенсибилизированы преимущественно к клещам домашней пыли, а у 37,5% больных выявлена сенсибилизация к эпидермальным аллергенам. Для пациентов с поллинозом была характерна гиперчувствительность к пыльце березы (56,8%) и злаковых трав (31,8%). Результаты риноцитограммы характеризовались наличием эозинофилии у больных аллергическим ринитом, и нейтрофилии у пациентов с ИР. Для оценки клеточного состава назального секрета использовали коэффициент соотношения процентного содержания эозинофилов к процентному содержанию нейтрофилов. Для аллергического воспаления полости носа этот коэффициент превышал 0,1. Для больных ИР была не характерна эозинофильная инфильтрация (коэффициент=0).
52 пациента с синуситами были обследованы в фазе острого инфекционного воспаления. Все они жаловались на гнойное отделяемое из полости носа. У большинства пациентов диагноз синусит был подтвержден рентгенологически.
Микробиологичнское исследование мазка из назальной полости выявило обильный рост S.aureus у 73,8%, C.pseudodiphtericum — у 34,5% и S.epidermidis у 33,3% больных аллергическим ринитом. У больных синуситами инфекция была обусловлена S.aureus (51,9%), S.pneumoniae (48,1%), C.pseudotuberculosis (32,7%), Pseudomonas aeroginosa (11,5%). Сравнительный анализ уровня ПО у пациентов с различными нозологическими формами представлен на рисунке 1.
Очевидно, что средние значения ПО во всех обследованных группах достоверно выше, чем у здоровых доноров (p Автор статьи: Зайцев Владимир Михайлович